厌氧发酵技术是生物制药领域的核心工艺之一，广泛应用于抗生素（如头孢菌素前体）、益生菌制剂（如双歧杆菌疫苗）、功能性小分子（如短链脂肪酸）等产品的研发与生产。其核心需求在于构建严格厌氧、参数稳定的微环境——若O₂残留量＞0.1%，会导致厌氧菌株呼吸链阻断；温度波动±1℃以上，将抑制菌体酶活；CO₂浓度失衡则会破坏培养基pH缓冲体系，最终导致产物合成效率下降30%以上。

传统普通厌氧培养箱存在三大局限：一是依赖氮气置换实现厌氧，O₂残留量难以稳定控制在0.05%以下；二是温度控制精度仅±0.5℃，且腔体内温度分布不均；三是缺乏CO₂实时调控模块，无法匹配菌株代谢对气体配比的动态需求。博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱针对上述痛点设计，集成了“真空-氮气置换-氧气催化”三级厌氧系统、PID智能控温模块及混合气体精准配比单元，但其在厌氧发酵生物制药中的具体应用效果尚未有系统研究。

本研究以产SCFAs的梭状芽孢杆菌为模式菌株，通过对比实验验证该设备对菌体生长、产物合成及发酵稳定性的调控作用，为其在生物制药科研及中试阶段的应用提供数据支撑。

一、材料与方法

（一）实验材料

1、菌株：梭状芽孢杆菌，购自美国典型培养物保藏中心，用于生产SCFAs。

2、培养基：庖肉培养基，121℃高压灭菌20min后冷却至室温。

3、核心设备：博清生物三气培养箱；普通厌氧培养箱；高效液相色谱仪；紫外分光光度计。

（二）实验方法

1、发酵体系构建

菌株活化：将梭状芽孢杆菌冻干粉接种至庖肉培养基，在博清生物三气培养箱中预培养24h（37℃，O₂≤0.05%，N₂ 100%），获得对数期种子液。

发酵接种：将种子液按5%（v/v）接种量接入500mL三角瓶（装液量200mL），分别置于博清生物三气培养箱（实验组）与普通厌氧培养箱（对照组）中，设定发酵参数：温度37℃，湿度80% RH，实验组CO₂/N₂=5%/95%，对照组无CO₂调控（仅N₂平衡）。

2、参数监测与检测

环境参数监测：每隔2h记录两组培养箱的腔体内温度、O₂浓度、CO₂浓度，计算24h内参数波动范围。

菌体生长检测：每隔4h取样，用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，绘制生长曲线；采用平板计数法计算菌落形成单位（CFU/mL）。

产物检测：发酵72h后，取样离心（8000r/min，10min），上清液经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测SCFAs浓度。

重复性验证：两组分别进行3次平行发酵实验，计算菌体浓度、SCFAs产量的CV值。

二、结果与分析

（一）培养箱环境参数稳定性对比

博清生物三气培养箱与普通厌氧培养箱的24h参数波动情况。实验组温度波动仅±0.08℃，O₂浓度稳定在0.03%-0.05%，CO₂浓度精准维持在5.0%±0.05%；对照组温度波动达±0.45℃，O₂浓度波动范围0.12%-0.28%，且无CO₂调控能力。这表明博清生物三气培养箱的多参数协同控制精度显著优于普通培养箱，可满足厌氧发酵对微环境稳定性的严苛需求。

（二）菌体生长情况分析

实验组菌体在12h进入对数期，28h达到稳定期，最大OD₆₀₀值为2.86，CFU/mL为1.92×10⁹；对照组在18h才进入对数期，34h达到稳定期，最大OD₆₀₀值为2.32，CFU/mL为1.56×10⁹。

关键原因分析：博清培养箱的低氧环境（O₂≤0.05%）减少了菌体的氧化应激损伤，提前启动对数期增殖；精准控温避免了酶活波动，而CO₂的稳定供给则维持了培养基pH在6.8-7.0的最佳范围，进一步促进菌体代谢。

（三）SCFAs合成效率对比

发酵72h后，实验组SCFAs总产量为16.8g/L（其中丁酸12.5g/L，乙酸4.3g/L），对照组总产量为14.2g/L（丁酸10.3g/L，乙酸3.9g/L），实验组产量提升18.2%。这是因为SCFAs合成依赖于菌体的乙酰辅酶A代谢通路，博清培养箱的稳定微环境提高了关键酶（如丁酸激酶）的活性，同时减少了代谢中间产物的流失。

（四）发酵过程重复性验证

3次平行实验结果显示，实验组菌体浓度的CV值为2.8%，SCFAs产量的CV值为3.1%；对照组菌体浓度CV值为7.5%，SCFAs产量CV值为8.3%。博清生物三气培养箱的低变异系数表明其可显著提升厌氧发酵的重复性，这对生物制药科研中“实验结果可复现”及中试放大的“工艺稳定性”至关重要。

三、讨论

本研究证实，博清生物三气培养箱通过三大核心优势提升厌氧发酵生物制药效率：

（一）三级厌氧系统：采用“真空抽除-氮气置换-钯催化剂除氧”流程，将O₂残留量控制在0.05%以下，解决了普通培养箱“厌氧不彻底”导致的菌体活性低问题；

（二）PID智能控温：通过腔体内多点温度传感器实时反馈，控温精度达±0.1℃，避免了温度波动对酶活的抑制，缩短菌体延迟期；

（三）动态气体配比：可根据菌株代谢需求灵活调整CO₂/N₂比例，本研究中5% CO₂的设定恰好匹配梭状芽孢杆菌的pH缓冲需求，减少了培养基酸碱调节带来的污染风险。

与现有研究对比，使用某品牌三气培养箱虽能将SCFAs产量提升12%，但O₂控制精度仅±0.08%，而博清生物三气培养箱的O₂精度达±0.03%，进一步降低了氧化损伤；同时，该设备集成的触摸屏与数据记录功能（可导出温度、气体浓度的实时曲线），为生物制药科研的“工艺追溯”提供了便利。

本研究的局限性在于仅针对梭状芽孢杆菌展开，未来可扩展至双歧杆菌、产甲烷菌等其他厌氧制药菌株，进一步验证设备的通用性；同时可结合响应面法，优化不同菌株对应的最佳气体配比与温度参数，形成“菌株-设备参数”匹配数据库。

博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱可通过精准控制温度、厌氧度及气体配比，为厌氧发酵生物制药构建稳定的微环境。在梭状芽孢杆菌产SCFAs的实验中，该设备使菌体对数期提前6h，最大菌体浓度提升23.5%，SCFAs产量提高18.2%，且发酵重复性（CV值3.1%）显著优于普通厌氧培养箱。

博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱可作为厌氧发酵生物制药科研、中试阶段的核心设备，为提升发酵效率、保障工艺稳定性提供关键技术支撑，具有广阔的应用前景。