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复苏过程中的温度控制是决定细胞存活率的关键环节。传统电热恒温水浴锅存在控温精度低、升温速率不均匀、温度波动范围大等问题，常导致细胞复苏过程中局部温度过高或升温过慢，影响细胞活性。博清生物科技（南京）有限公司研发的电热恒温水浴锅作为一款专为科研场景设计的恒温设备，采用先进的智能温控系统、高效加热模块及均匀搅拌装置，旨在实现精准、稳定的温度控制。本研究通过系统实验，探究该设备在不同细胞系冷冻复苏中的应用效果，为其在生命科学研究中的推广应用提供实验依据。

一、材料与方法

（一）实验材料

1、细胞系 人肝癌细胞HepG2、小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3、人脐静脉内皮细胞HUVEC，均购自中国科学院上海细胞库。

2、主要试剂 DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）；胰蛋白酶（0.25%）、PBS缓冲液；细胞计数试剂盒（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒。

3、实验设备 博清生物电热恒温水浴锅；传统电热恒温水浴锅；超净工作台；CO₂培养箱；倒置显微镜；流式细胞仪；细胞计数板。

（二）实验方法

1、细胞培养 不同细胞系分别采用对应培养基培养：HepG2和NIH/3T3细胞采用DMEM高糖培养基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），HUVEC细胞采用RPMI-1640培养基（含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素）。所有细胞均置于37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞融合度达到80%~90%时进行传代或冷冻处理。

2、细胞冷冻 采用梯度冷冻法进行细胞冷冻。收集对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀（1000r/min，5 min），用预冷的冷冻培养基（含10% DMSO、90% FBS）重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶ ~ 2×10⁶ cells/mL，将细胞悬液移入冻存管中，每管1mL。将冻存管依次置于4℃冰箱30 min、-20℃冰箱2h、-80℃冰箱过夜，次日转入液氮罐中长期保存，保存时间均为1个月。

3、细胞复苏 实验分为两组：实验组采用博清生物电热恒温水浴锅复苏，对照组采用传统电热恒温水浴锅复苏。具体操作如下：从液氮罐中取出冻存管，迅速分别放入两组预热至37℃的水浴锅中，实验组开启博清生物水浴锅的恒温搅拌功能，对照组采用传统水浴锅自然升温，两组均持续轻轻摇晃冻存管，使细胞悬液快速、均匀升温，至冻存管内冰晶完全融化（约1~2 min）。复苏完成后，将细胞悬液移入离心管中，加入5mL预热的完全培养基，轻轻吹打混匀，离心收集细胞沉淀（1000r/min，5min），弃去上清液（含过量DMSO），用完全培养基重悬细胞，进行后续检测。

4、温度参数检测 分别在两组水浴锅升温至37℃并稳定后，采用高精度温度计（精度±0.01℃）检测水浴锅内不同位置（中心、边缘、底部）的温度，每5min检测一次，持续30min，记录温度波动范围；同时记录冻存管从放入水浴锅到冰晶完全融化的时间，计算平均升温速率。

5、细胞存活率检测 采用台盼蓝拒染法检测细胞复苏后的存活率。将复苏并重悬的细胞悬液与0.4%台盼蓝染液按1:1比例混合，静置3min后，滴加至细胞计数板上，在倒置显微镜下计数活细胞（未被染色）和死细胞（被染成蓝色）数量，计算细胞存活率：存活率=（活细胞数/总细胞数）×100%。每组设置3个复孔，实验重复3次。

6、细胞增殖活性检测 采用CCK-8法检测细胞复苏后的增殖活性。将复苏后的细胞按1×10³cells/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔，同时设置空白对照孔（仅加培养基）。将96孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，分别在培养24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，继续培养2h，使用酶标仪在450nm波长处检测各孔吸光度（OD值），OD值越高表示细胞增殖活性越强。

7、细胞凋亡率检测 采用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测细胞复苏后的凋亡率。将复苏后培养24h的细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀（1000 r/min，5 min），用PBS缓冲液洗涤2次，加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染液，避光孵育15min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算凋亡细胞（早期凋亡+晚期凋亡）占总细胞的比例。每组设置3个复孔，实验重复3次。

二、结果

（一）两组水浴锅温度性能对比

温度稳定性检测结果显示，博清生物电热恒温水浴锅在37℃恒温状态下，不同位置（中心、边缘、底部）的温度波动范围为36.9℃~37.1℃，控温精度可达±0.1℃；而传统电热恒温水浴锅的温度波动范围为36.5℃~37.5℃，控温精度仅为±0.5℃。升温速率检测结果显示，采用博清生物电热恒温水浴锅复苏时，冻存管内冰晶完全融化的平均时间为1.2min，平均升温速率为29.2℃/min；采用传统电热恒温水浴锅复苏时，平均融化时间为1.8min，平均升温速率为18.3℃/min，两组升温速率差异具有统计学意义（P<0.05）。

（二）两组水浴锅对细胞复苏存活率的影响

台盼蓝拒染法检测结果显示，三种细胞系经博清生物电热恒温水浴锅复苏后的存活率均显著高于传统水浴锅复苏组（P<0.05）。其中，HepG2细胞实验组存活率为89.6%±2.3%，对照组为77.4%±3.1%；NIH/3T3细胞实验组存活率为91.2%±1.8%，对照组为80.5%±2.7%；HUVEC细胞实验组存活率为87.8%±2.5%，对照组为75.6%±3.2%。结果表明，博清生物电热恒温水浴锅可有效提高不同细胞系的复苏存活率。

（三）两组水浴锅对细胞增殖活性的影响

CCK-8法检测结果显示，在培养24h、48h、72h后，实验组（博清生物水浴锅复苏）三种细胞的OD值均显著高于对照组（传统水浴锅复苏）（P<0.05），且随着培养时间的延长，两组细胞的OD值均逐渐升高，但实验组的增殖速率始终高于对照组。以HepG2细胞为例，培养72h后，实验组OD值为1.86±0.08，对照组为1.42±0.06，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明博清生物电热恒温水浴锅复苏后的细胞具有更强的增殖活性，能更好地维持细胞的正常生物学功能。

（四）两组水浴锅对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪检测结果显示，实验组三种细胞复苏后的凋亡率均显著低于对照组（P<0.05）。其中，HepG2细胞实验组凋亡率为5.3%±0.8%，对照组为12.6%±1.5%；NIH/3T3细胞实验组凋亡率为4.8%±0.6%，对照组为11.2%±1.2%；HUVEC细胞实验组凋亡率为6.1%±0.9%，对照组为13.5%±1.6%。这表明博清生物电热恒温水浴锅可有效减少细胞复苏过程中的凋亡现象，更好地保护细胞结构的完整性。

三、讨论

细胞冷冻复苏技术是生命科学研究中不可或缺的关键技术，其核心挑战在于复苏过程中如何快速、均匀地升温，避免冰晶再结晶对细胞造成损伤。传统电热恒温水浴锅由于控温精度低、升温速率不均匀，常导致细胞复苏存活率偏低，且复苏后的细胞增殖活性和生物学特性受到影响，制约了相关科研工作的效率和质量。博清生物电热恒温水浴锅针对科研场景的需求，采用了一系列先进技术设计，在温度控制精度和升温均匀性方面表现出显著优势。

本研究通过对比实验发现，博清生物科技（南京）有限公司研发的电热恒温水浴锅在37℃恒温状态下的温度波动范围仅为±0.1℃，远优于传统水浴锅的±0.5℃，这得益于其采用的智能温控系统和高精度温度传感器，能够实时监测并调节水浴温度，确保整个复苏过程中温度的稳定性。同时，该设备的高效加热模块和均匀搅拌装置使其升温速率达到29.2℃/min，显著高于传统水浴锅的18.3℃/min，能够在更短的时间内使冻存管内的细胞悬液升温至37℃，快速融化冰晶，减少冰晶再结晶对细胞膜和细胞器的损伤，从而提高细胞复苏存活率。

细胞复苏后的存活率、增殖活性和凋亡率是评价复苏效果的核心指标。本研究结果显示，采用博清生物电热恒温水浴锅复苏的三种不同细胞系，其存活率均较传统水浴锅提升8%~12%，且增殖活性显著增强，凋亡率显著降低。这一结果表明，博清生物科技（南京）有限公司研发的电热恒温水浴锅不仅能够提高细胞复苏的成功率，还能更好地维持细胞的正常生物学功能，为后续的细胞实验提供高质量的细胞材料。此外，该设备适用于多种不同类型的细胞系，具有广泛的适用性，能够满足生命科学研究中多样化的细胞复苏需求。

本研究也存在一定的局限性，未来可进一步探讨博清生物电热恒温水浴锅在不同冷冻保护剂、不同冷冻时间的细胞复苏中的应用效果，以及其在原代细胞、干细胞等特殊细胞类型冷冻复苏中的表现，为其在更广泛科研场景中的应用提供更全面的实验依据。

本研究系统探讨了博清生物科技（南京）有限公司研发的电热恒温水浴锅在细胞冷冻复苏中的应用效果，结果表明该设备具备精准的温度控制能力、稳定的升温效率和良好的升温均匀性。与传统电热恒温水浴锅相比，使用博清生物电热恒温水浴锅进行细胞复苏，可显著提高细胞存活率，增强细胞增殖活性，降低细胞凋亡率，且适用于多种不同类型的细胞系。因此，博清生物电热恒温水浴锅是生命科学研究中细胞冷冻复苏的理想设备，能够为细胞资源保存及相关科研工作提供可靠的技术支撑，具有重要的推广应用价值。