病毒滴度是衡量病毒感染性强弱的核心指标，直接影响病毒学基础研究及疫苗研发的准确性与可靠性。病毒滴度测定的关键前提是获得高质量、高纯度的病毒核酸，其提取效率与纯度直接决定后续qPCR、数字PCR等检测方法的灵敏度与重复性。

传统病毒核酸提取依赖手动操作，存在操作步骤繁琐、耗时较长（单次提取需40~60min）、人为误差大、易交叉污染等问题，尤其在疫苗研发的批量样本（如发酵液、纯化中间品）检测中，难以满足高效、标准化的需求。博清生物科技（南京）有限公司研发的核酸提取仪基于磁珠法原理，整合样本裂解、核酸结合、洗涤、洗脱全流程自动化操作，具有提取效率高（单次可处理96份样本，耗时<25min）、操作标准化、污染风险低等优势，但该仪器在病毒滴度测定场景中的应用效果尚未系统验证。

一、材料与方法

（一）实验材料

1、仪器：博清生物核酸提取仪；实时荧光定量PCR仪；高速离心机。

2、病毒样本：SARS-CoV-2病毒株；甲型流感病毒H1N1株；重组腺病毒Ad5-EGFP株，均经Vero细胞培养扩增，病毒液浓度梯度为10¹~10⁶TCID50/mL。

3、试剂：磁珠法病毒核酸提取试剂盒；酚-氯仿-异戊醇混合液；SuperScript III One-Step qRT-PCR Kit；SARS-CoV-2 ORF1ab基因引物探针、H1N1 HA基因引物探针、Ad5 E1A 基因引物探针。

4、标准品：SARS-CoV-2 RNA标准品。

（二）实验方法

1、病毒样本预处理

取各病毒液（10¹~10⁶ TCID50/mL），每浓度梯度设3个重复，4℃下8000×g离心10min，去除细胞碎片，取上清液作为核酸提取样本，体积均为 200μL。

2、核酸提取

试验组（博清生物核酸提取仪）：按照仪器操作说明书，将200μL病毒上清液与20μL蛋白酶K、200μL裂解液混合，加入仪器样本孔，选择“病毒核酸提取程序”（裂解温度56℃，时间10min；洗脱体积50μL），自动完成提取，收集洗脱液即为病毒核酸。

对照组（传统手动酚-氯仿法）：取200μL病毒上清液，加入200μL酚-氯仿-异戊醇混合液，涡旋振荡5min，12000×g离心10min，取上层水相；加入等体积异丙醇沉淀核酸，-20℃静置30min，12000×g离心15min，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后用50μL无酶水溶解，即为病毒核酸。

3、核酸质量检测

采用超微量分光光度计测定核酸浓度（ng/μL）及纯度（A260/A280比值，合格范围1.8~2.0）；每个样本重复检测3次，计算均值与标准差（SD）。

4、病毒滴度测定（qPCR法）

qPCR反应体系：20μL体系，含SuperScript III酶混合液10μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8μL、探针（5μmol/L）0.4μL、病毒核酸模板2μL、无酶水6μL。

qPCR反应条件：逆转录阶段50℃ 30min；预变性95℃ 2min；扩增阶段95℃ 15s、60℃ 30s，共40个循环，收集荧光信号。

滴度计算：以SARS-CoV-2 RNA标准品绘制标准曲线（CT值与拷贝数对数的线性回归方程），根据样本CT值计算病毒核酸拷贝数；结合病毒培养体系体积与稀释倍数，换算为病毒滴度（TCID50/mL），公式参考Reed-Muench法。

5、数据分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量数据以“均值±SD”表示，组间比较采用独立样本t检验；相关性分析采用Pearson相关系数；P<0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

（一）核酸提取效率与纯度对比

试验组对3种病毒样本的核酸提取浓度均显著高于对照组（P<0.01），且A260/A280比值更接近理想范围（1.8~2.0），无明显蛋白或有机溶剂污染。其中，SARS-CoV-2样本的提取浓度提升最显著，试验组均值（302.4ng/μL）较对照组（201.7ng/μL）提高50.0%。

（二）核酸提取重复性分析

试验组对同一浓度病毒样本（10⁴ TCID50/mL）的3次重复提取中，核酸浓度的CV值均 <4.2%，显著低于对照组（CV>7.5%）；qPCR检测的CT值变异系数同样表现更优，试验组CV均<3.8%，对照组CV>6.9%，表明博清生物核酸提取仪的操作标准化程度更高，重复性更稳定。

（三）病毒滴度测定结果对比

两种方法测定的病毒滴度呈强正相关（R²=0.986，P<0.001），但试验组测定结果更接近标准品参考值。以SARS-CoV-2 10⁴ TCID50/mL标准样本为例，试验组测定值为（9.8±0.3）×10³ TCID50/mL，误差仅2.0%；对照组测定值为（8.2±0.5）×10³ TCID50/mL，误差达18.0%，表明博清生物核酸提取仪可提升病毒滴度测定的准确性。

三、讨论

本研究从核酸提取效率、重复性及滴度测定准确性三个核心维度，验证了博清生物核酸提取仪在病毒学研究与疫苗研发中的适用性，其优势主要体现在以下三方面：

（一）高效提取与高纯度核酸：博清生物核酸提取仪采用磁珠法特异性结合病毒核酸，配合自动化裂解与洗脱程序，避免了传统酚-氯仿法中有机溶剂残留、蛋白污染等问题，使核酸纯度（A260/A280≈1.89）更符合qPCR检测需求；同时，仪器单次提取耗时<25min，且支持96份样本批量处理，显著提升疫苗研发中批量样本（如发酵液、纯化中间品）的检测效率。

（二）稳定的重复性：传统手动提取依赖操作人员的技术熟练度，易因加样误差、离心时间差异等引入人为干扰；而博清生物仪器通过标准化程序控制温度、转速、试剂加样量等关键参数，使核酸浓度与qPCR CT值的CV均<4.2%，满足疫苗生产中“批次一致性”的质控要求。

（三）准确的滴度测定结果：病毒滴度测定的准确性依赖核酸提取的完整性——博清生物仪器的裂解缓冲液可高效破坏病毒衣壳，释放RNA/DNA，减少核酸降解；结合其高提取效率，使qPCR检测的靶基因拷贝数更接近实际病毒量，滴度测定误差<5%，显著优于传统方法（误差>15%），为疫苗抗原含量标定、病毒致病机制研究提供可靠数据。

本研究的局限性在于未涉及复杂基质样本（如含血清的病毒培养上清）的提取效果，后续可进一步验证仪器在临床样本或疫苗生产复杂基质中的应用性能。此外，博清生物核酸提取仪可与qPCR仪联动，构建“提取-检测”一体化流程，未来可探索其在病毒快速诊断与疫苗应急研发中的应用潜力。

博清生物科技（南京）有限公司研发的核酸提取仪可高效、稳定地完成SARS-CoV-2、甲型流感病毒、重组腺病毒等多种病毒的核酸提取，其提取的核酸浓度高、纯度优，且重复性显著优于传统手动方法。该仪器可通过提升核酸提取质量，保障后续qPCR检测的准确性，进而实现病毒滴度的精准测定，适用于病毒学基础研究、疫苗研发及生产质控等场景，具有较高的推广应用价值。